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用"OD600"測定微生物生長曲線
來源: Admin    更新時間: 2019-12-05    瀏覽: 247 人次
 

你還記得在微生物相關研究中做了哪些實驗嗎?顯然,我無法想起來每一個實驗細節,但我確信測定OD600的值是一個必不可少的實驗:取樣品至比色皿中,測定600nm波長下的OD值并記錄OD值隨時間的變化。雖然10年過去了,但是通過測定OD600來測定微生物生長曲線的方法,相比以往,如今仍然在被大量使用著。所以我們有足夠理由要來解釋下:為什么這種方法仍被如此廣泛使用,這種方法會如何發展以及我們在OD600測定過程中需要注意哪些事情。

內容目錄

1.OD600應用于哪些實驗?

2.微生物的不同生長時期

3.用OD600監測微生物生長曲線的原理

4.用OD600監測微生物生長曲線所需注意事項

5.OD600檢測的應用前景

6.監測微生物生長曲線的可替代方案

7.基于BMG酶標儀的微生物學研究

8.參考文獻

OD600應用于哪些實驗?

OD600可提供相關信息,反映細菌或酵母等微生物的生長狀況。更具體來說,微生物生長狀況與種群中微生物的數量有關,也可反映其如何隨時間的變化而變化。反映微生物生長狀況的信息可應用在各種生物和醫學研究領域:


>抗生素耐藥性:當前,針對多重耐藥致病菌的感染人數和因感染而死亡的人數都在不斷增加。為了控制這些致病菌,亟須不斷開發新的藥物或者治療方法。在新抗菌體系研發過程中,通過測定OD600評估抗生素對微生物生長的抑制效果,進而判斷該抗菌體系的效價。


>微生物發酵生產:微生物本身可以說是工業產品,例如用于生產烘焙食品或奶酪。然而,微生物同時也可用于工業生產,例如發酵生產酶、抗生素、維生素等工業產品。微生物的這兩種用途都需要包括生長特性在內的初始菌種條件優化。一旦建立了菌株及其生物發酵制程,相應的發酵生產過程就需要實時監測起來。同樣,這些監測包含通過監測OD600的變化來監測發酵生產所處的階段。


>合成生物學:合成生物學是一門新興的前沿熱門學科,它利用基因工程學的經典方法來構建特定屬性的生物系統。這也意味著需要對生物合成“機器”進行合理設計,包括對遺傳機制的高度修飾,甚至修飾合成整個人工基因組。通過這些基因修飾構建出的基因工程菌可以生產一些石化產品的替代品,如生物燃料或塑料,以及可以檢測污染物或降解塑料的微生物制品。合成生物學的這些大部分工作是在大腸桿菌或釀酒酵母等微生物中進行的。同樣,整個生物發酵過程需要實時測定OD600來監測相關微生物的生長情況。

微生物的不同生長時期

監測微生物種群隨時間的生長變化可以得到一條相應的生長特性曲線(如圖1),該曲線由四個階段組成:

圖1,微生物生長曲線完整周期示意圖


遲緩期(Lag Phase)在培養基中接種少量微生物開始培養后,微生物需要適應新的環境,這個階段沒有細胞分裂,同樣生物量也保持不變。


對數期(Log Phase)微生物一旦適應了新的環境就開始復制生長。每個細胞在特定的時間復制,進而出現細胞數量快速指數式增長。對數生長期生長速率最快,因此可進一步用于計算倍增時間、生長速率等參數。


穩定期(Stationary Phase)微生物的生長受到培養基中營養物質的限制。一旦碳源或其他關鍵營養物質用完,微生物就會停止生長。這一階段的生長曲線反映的是微生物高生物量的穩定時期。


衰亡期(Death Phase)由于缺乏營養物質、鹽、氨基酸,以及有害物質如酸或乙醇的增加,微生物生長環境變得惡劣起來,微生物也隨之開始死亡,反映在生長曲線上就是微生物生物量變得整體下降。

用OD600監測微生物生長曲線的原理

監測微生物生長曲線最常用的方法為測定600nm波長下的光密度,即OD600吸光度。該方法基于吸光度檢測模式,主要檢測穿過樣本的那部分光,具體來說就是穿過微生物懸液的那部分光。那么透射光與微生物的生長過程又有什么關系呢?由于溶液中的顆粒本身會產生散射光,并且溶液中的顆粒越多,相應的散射光就越強,因此,微生物懸液中隨著細菌或酵母細胞數量的成倍增加,相應的散射光和所測定的吸光度值也就隨之增加。這也意味著,利用吸光度模式檢測微生物細胞數量,其吸光度測定值僅僅是用來反映溶液中微生物的散射光光強度,而不是反映對光有吸收的物質對光的物理吸收特性。這一點很重要:OD600數值所反映的結果其實不是微生物樣品的吸光度,而是微生物樣品顆粒的散射光強度。

用OD600監測微生物生長曲線所需注意事項

如上所述,由于OD600檢測的是散射光而不是吸收光,并且吸收光常用的比爾定律描述的是吸光度值與對光有吸收的物質濃度線性關系, 因此比爾定律在理論上并不適用于微生物OD600的檢測。然而實踐表明,盡管微生物OD600的檢測沒有光吸收信息,比爾定律仍然適用于低密度微生物。換句話來說,對于低密度微生物懸液,OD600值可以跟微生物細胞數量有直接的換算關系。對于高密度微生物懸液,OD600的測定數據則更像是拋物線形式的。如果想要用OD600的值來反映高密度微生物懸液樣品濃度,那么針對不同的微生物,OD600的值和相應的細胞數量都需要做相應的換算校正1。


比色皿還是微孔板?

在對大容量的生物制程進行監測過程中,一般推薦使用比色皿。這種監測,通常需要每隔一定時間(如1小時),測定微生物的生長狀況。每次檢測需要大約1.5ml微生物懸液,并且檢測之前需要一定時間進行樣品抽。ㄈ鐖D2)。

圖2,酵母培養發酵罐樣品抽提


微孔板則主要用于長時間連續監測微生物生長狀況。檢測過程中,每孔只需200微升懸液,設定相應檢測間隔時間,儀器便可自動實時監測微生物生長狀況。因為通常所用的微孔板為96孔板,所以這種檢測方法非常適合于不同培養基條件或者不同菌株的多樣品重復長時間自動監測。


哪些儀器可用?

利用用吸光度功能測定顆粒的散射光,使用不同儀器會有不同結果。原因是不同的儀器使用不同的光束,并且探測器的位置到樣品的距離也不同。對于微生物懸液產生的散射光,由于距離樣品不同距離的檢測器,其收集的散射光信號不同,例如,距離近的檢測器可以檢測到散射光,距離遠的檢測器則可能檢測不到散射光(如圖3)。因此,推薦使用可用OD600來監測微生物生長過程的專用儀器來做此類檢測。顯然,如果要用比色皿或者微孔板來檢測,我們只能選擇分光光度計或酶標儀。而可以同時使用比色皿和微孔板來檢測的設備,例如BMG SPECTROstar Nano,對于此類應用會是一種更好的選擇,可以滿足未來所有的實驗需求。

圖3,不同的設備會有不同檢測結果。相同大小的檢測器,越靠近微生物樣品,越能檢測到相應的散射光信號,距離太遠的檢測器,則檢測不到散射光信號


什么時候需要校準?

如果要用OD600來確定溶液中微生物的細胞數量或濃度(細胞數/ml),或者校正OD600散射光測定的非線性問題,那么需要對此方法進行校準。校準過程中,需要先制備已知微生物濃度的微生物懸液,然后在所用儀器上使用與后續實驗相同的體積來測定OD600,最后可使用這些測量值制作校準曲線。之后,便可通過未知樣本的OD600值,根據校準曲線來測算微生物樣品濃度。由于散射光強度會隨顆粒大小或形狀而改變,所以針對不同的微生物,推薦測定相應的校準曲線來測算微生物樣品濃度。同樣,當更換分析儀器或者樣品體積時,散射光和樣品濃度對應的校準曲線也是需要重新測定的。

OD600檢測的應用前景

在微孔板中用OD600測定微生物生長曲線的方法,正在越來越多地與熒光或發光等檢測模式結合起來。微生物生長曲線的測定也可作為另一種檢測指標的歸一化內參來使用。例如發表在Nucleic Acids Research雜志上的一篇文章,作者使用CLARIOstar多功能酶標儀檢測金黃色葡萄球菌的蛋白翻譯過程2。該文章采用熒光模式檢測半乳糖苷酶活性,而反映該酶活性的熒光信號,則通過同時檢測OD600來做歸一化處理。另外一篇文章使用發光模式檢測單核細胞增多癥李氏菌的基因表達,其中反映基因表達情況的化學發光信號,同樣是通過同時檢測OD600來做歸一化處理3。這些檢測模式的結合應用,為基于微生物單細胞層面的基因轉錄或者蛋白表達定量分析提供了更好的解決方案。

監測微生物生長曲線的可替代方案

濁度法

濁度法測定微生物的生長曲線也是基于檢測微生物懸液散射光的原理。與OD600測定(OD600測定的是微生物的散射光,所以OD600在這個應用里收集的不是透射光)不同的是,濁度法只是直接檢測微生物的散射光。BMG LABTECH公司應用手冊中,Nephelometric monitoring growth of Candida albicans using BMG LABTECH’s NEPHELOstar® Plus這篇應用介紹了如何使用NEPHELOstar 濁度儀通過96孔板來測定白念珠菌的生長曲線。與吸光度法相比,濁度法靈敏度更高,能檢測更少量的顆粒物,因此更加適用于超低濃度的微生物懸液定量監測。


熒光基團表達

在微生物細胞內可穩定表達的一些熒光蛋白例如GFP/RFP等,同樣可用來反映微生物的生長情況。熒光強度與熒光蛋白的濃度是呈線性關系的,因此當表達有熒光蛋白的微生物數量增加時,相應的熒光信號也會成比例的增強。BMG LABTECH公司應用手冊中,Expression of a stable green fluorescent protein mutant in group B streptococcus. Growth, detection and monitoring, with the CLARIOstar® compares microbial growth determination這篇應用詳細介紹了如何通過同時測定微生物表達的GFP熒光和相應的OD600數據來分析微生物的生長狀況,并首次引入熒光偏振的方法,來克服微生物自發熒光的干擾問題。

基于BMG酶標儀的微生物學研究

BMG酶標儀開發有多種多樣的微生物生長曲線測定方案,如果您想了解更多微生物研究相關解決方案,請查看BMG公司微生物檢測分析專題應用手冊。

推薦閱讀:微生物研究實用工具和高通量解決方案

參考文獻

1. Keiran Stevenson et al. (2016) General calibration of microbial growth in microplate readers Scientific Reports (6), Article number: 38828 (2016). DOI: 10.1038/srep38828

2. Tatiana Rochat et al. (2018) The conserved regulatory RNA RsaE down-regulates the arginine degradation pathway in Staphylococcus aureus Nucleic Acids Res. 2018 Sep 28;46(17):8803-8816. DOI: 10.1093/nar/gky584

3. Emilia Krypotou et al. (2019) Control of Bacterial Virulence through the Peptide Signature of the Habitat Cell Rep. 2019 Feb 12;26(7):1815-1827.e5. DOI: 10.1016/j.celrep.2019.01.073.


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